Keď už bakuly, tak poriadnu a vyberal som nech ma to aj baví a poriadne ! ... konopnú rešerš vystrihnem, o konopy toho vieme všetci až dosť, o Trichoderme to sú ale často veľmi zaujímavé fatky tak to sem hodím.

Je to osekaný text, bez grafov, tabuliek a obrázkov. Full verziu nahrám na požiadanie.

Výsledky pokusu a ich zhodnotenie a odôvodnenie nájdete na konci v kapitole Výsledky a Diskusia


Je pravdepodobné, že výsledky sa nedajú považovať za 100% aplikovateľné aj na členmi Groweru pestovanú trávu. Z toho dôvodu poprosím vyjadrenie v ankete, aby som zistil, či výsledok ovplivnuje získaná jednodomosť použého konope.

Abstrakt

Cieľom tejto práce je odhalenie možných pozitívnych či negatívnych vplyvov masívnej inokulácie pôdy symbiotickým organizmom na technickú konopu (Cannabis sativa). Pokus bol realizovaný na pracovných plochách výskumnej stanice Českej zemědělskej univerzity Červený újezd. Prvá plocha bola naočkovaná hubou Trichoderma harzanium a druhá slúži ako kontrola. Analýza dát ukázala, že zvolená symbiotická huba v tejto konkrétnej aplikačnej koncentrácii negatívne vplýva na hormonálnu rovnováhu jednodomej variety technickej konopy Bialobrzeskie a spôsobuje výrazne vyšší výskyt samčích rastlín oproti samičím. Súčasne ale pozitívne ovplyvňuje hospodárenie rastliny s vodou. Ošetrené plochy vykazovali menší úhyn rastlín v obdobiach sucha. Z tohoto výsledku je zrejmé, že použitie Trichodermy harzanium pri pestovaní technickej konopy je vhodné do porastov, ktoré sú pestované výhradne na vlákno, kde žatva prebieha ešte pred odumretím samčích rastlín.
Kľúčové slová: mykorhiza, symbióza, trichoderma harzanium, konopa.

Úvod

Vďaka firemnej lobby vo vláde USA, rozvoju drogovej kultúry a následnému vzniku celosvetovej konopnej antipropagandy, poľnohospodári na pestovanie konopy siatej na viac než polstoročie značne zanevreli. Vďaka vyšľachteniu špeciálnych odrôd s takmer nulovým obsahom psychoaktívnych látok, tzv. technickej konopy, zažíva táto plodina celosvetový nárast záujmu. Na tomto znovuobjavení konopy má zásluhu aj vedecká obec, ktorá aj za pomoci nových technológií, odhaľuje skutočnosť, že konopné výrobky sa často vyrovnajú a aj predčia mnohé syntetické a prírodné produkty. Pestovatelia konopy, tak ako aj ostatní poľnohospodári, hľadajú prostriedky ako zvýšiť výnos a kvalitu a zabezpečiť účinnejšiu ochranu rastlín. Myšlienky ekologického poľnohospodárstva a trvale udržiteľného rozvoja sa zaoberajú aj využitím mikroorganizmov v procese pestovania.. Trichoderma harzanium má mnoho podložených pozitívnych efektov na rastlinu korene ktorej kolonizuje. V tejto práci budú sledované zmeny v poraste technickej konopy siatej po aplikácii Trichodermy harzanium.


Cannabis sativa a zmeny pohlavia

U pôvodných druhov konopy rozoznávame samčie a samičie rastliny. Vyskytujú sa tu pohlavné heterochromozómy X a Y. Samčí chromozóm Y, je narozdiel od ľudí a mnoho iných živočíchov, väčší ako samičí chromozóm X. V normálnom poraste sa vyskytuje cca 53 % samčích a 47 % samičích rastlín (Petříková et al., 2006; Mandolino et Carboni, 2004).
Pohlavie môžu ovplyvniť aj mnohé vonkajšie faktory. Vyššia koncentrácia auxínov a cytokinínov zvyšuje počet samičích rastlín. Vyššia intenzita svetla, kratšia fotoperióda, nižšia teplota ako aj zvýšená koncentrácia gibberellínov zvyšuje počty samcov (Korpelainen, 1998).
Pomer hormónov má však väčší vplyv na pohlavie ako ich samotná koncentrácia. U konopy má značný vplyv na pohlavie pomer cytokinínov/auxínov a kyseliny giberelovej (GA3). Aplikácia GA3 (25 mg/l) pôsobila v konopnom záhone na zmenu pohlaví v prospech samčích rastlín až na pomer 80:20. Naopak pôsobenie 25 mg/l benzyl adenínu (syntetický cytokinín) a kyseliny indol-3-octovej (auxín) vyústilo k 100 % výskytu samičích rastlín (Chailakhyan & Khryanin, 1978). Efekt kyseliny giberelovej môže byť úplne potlačený aplikáciou rovnakého množstva kyseliny abscisovej, ktorá ale samotná nemá na pohlavie rastliny žiadny vplyv (Ram et Jaiswal, 1972)
Samčie rastliny často v prvej rastovej fáze predbehnú samičie, majú užšie stonky a ich listy majú svetlejšiu farbu. Po kvitnutí, ktoré nastáva cca mesiac pred kvetom samičích jedincov usychajú. Samec je po otvorení žlto-zelených prašníkov (laty) schopný opeliť samicu vzdialenú až 12 km.
Samice bývajú viac olistené, tmavšie a mohutnejšie. Približne v dobe zrenia samcov sa u samíc vytvárajú zväzky stopkatých kvetov so zeleným okvetím, pestíkom a dvoma načervenalími bliznami (Ruman et Klvaňová, 2008).




Trichoderma

4.5 Charakteristika rodu Trichoderma

Trichoderma je rod nepohlavne sa rozmožujúcej pôdnej huby, patriacej k vreckatým hubám (ascomycota) ktorý existuje približne 100 mil. rokov (Danielson & Davey, 1973). Bol prvý krát popísaný C.H. Persoonom pred 220 rokmi a obsahoval 4 druhy, z ktorých v pôvodnom rode zostal iba jeden, Trichoderma viride (Limón et Codón, 2004). V posledných desaťročiach je rod Trichoderma intenzívne študovaný na molekulárnej úrovni, vďaka čomu dnes poznáme už viac než 100 druhov (19 vyskytujúcich sa v ČR). Aj keď spóry tohto rodu tvoria iba 3% celkového počtu spórov v pôde, je vďaka svojim vlastnostiam a vysokej genetickej premenlivosti jednou z najrozšírenejších pôdných húb (Danielson & Davey, 1973).
Hlavným a najznámejším znakom je schopnosť produkcie enzýmov degradujúcich celulózu a chitín. Produkujú ale aj iné nemenej zaujímavé enzýmy, či extracelulárne proteíny. Rôzne druhy produkujú dohromady viac než stovku rôznych metabolitov s dokázaným antibakteriálnym účinkom (Harman et Kubicek, 1998).
Trichoderma parazituje na rade iných húb, k čomu jej pomáhajú sekundárne metabolity (Harman et al., 2004).

4.5.1 Výskyt

Najväčšie populácie sa vyskytujú v F a G horizonte pôdy. Rôzne druhy tohoto rodu môžu preferovať rôzne podmienky. T. viride a T. polysporum najlepšie kolonizujú v chladných podmienkach, v podmienkach s vysokou vlhkosťou boli dominantnou formou T. pseudokoningii a T. hamatum, ktorá spoločne s T. koningii má pravdepodobne najširší areál rozšírenia. Trichoderma harzanium má ťažisko svojho výskytu v teplých oblastiach.
V každom grame pôdy mierneho až tropického pásma sa nájde 10 – 1000 životaschopných spór (Danielson et Davey, 1973).

4.5.2 Odolnosť Trichodermy spp. a škody ktoré spôsobuje

Druhy rodu Trichoderma sa vyznačujú vysokou odolnosťou voči pôsobeniu obranných látok rastlín ako aj ťažkých kovov, kde reguluje alebo zabraňuje ich preniknutiu do buniek. Tak isto dobre odoláva antibiotikám iných mikroorganizmov a aj chemickým fungicídom. Pravdepodobne aj z tohoto dôvodu je často sa vyskytujúcim škodcom na hubových farmách. Najväčšími stratami trpia pestovatelia hlivy ústricovej (Pleurotus ostreatus) a žampiňonov (Agaricus campestris a bisporus), kde je výnos po napadnutí Trichodermou znížený o 30 – 100 %. Škody sú u hlivy spôsobené hlavne druhmi Trichoderma pleurotum a Trichoderma pleuroticola a Trichodermou aggressivum u žampiňonov. Trichoderma haraznium síce bola nájdená v pestovateľských substrátoch týchto húb, ale nebol zaznamenaný prípad jej masívneho šírenia v týchto podmienkach (Schuster et Schmoll, 2010).

4.6 Charakteristika druhu Trichoderma harzanium
Trichoderma harzanium je vďaka svojím vlastnostiam, ktoré zatiaľ stále niesú úplne preskúmané, jedným z najperspektívnejších druhov rodu Trichoderma.

4.6.1 Využitie

Trichoderma bojuje proti rastlinným patogénom (Limón et Codón, 2004 a Monte, 2001) a zlepšuje obranyschopnosť rastliny (Martínez-Medina et al., 2010), taktiež je schopná urýchliť rast a vývoj rastlín a zväčšiť hmotnosť sušiny (Ousley et al., 1994a, Martínez-Medina et al., 2010 a Yedidia et al., 2001), zvýšiť klíčivosť semien (Kleifeld et Chet, 1992), tak ako aj zvýšiť počet a váhu kvetov až o 40% (Ousley et al., 1994b).

4.6.2 Vplyv na rastliny

Inokulácia TH ovplyvňuje hormonálny systém rastliny. Bol zaznamenaný významný nárast koncentrácie GA3 (kyselina giberelová), ACC (kyselina 1-aminocyklopropan-1-karboxylová), ABA (kyselina abscisová), Ze (zeatin) a aj najvýznamnejšieho auxínu IAA (kyselina indol-3-octová) (Martínez-Medina et al., 2010; Honeefat et al., 2012). Po tom, čo mali rastlinní mutanti s poškodeným transportom auxínu značne zníženú rastovú odozvu po inokulácii Trichodermou, bolo jasné, že práve pôsobenie Trichodermy na tvorbu auxínu IAA je najviac zodpovedné za podporu rastu nadzemných častí ako aj laterálnych koreňov a koreňových vláskov (Contreras-Cornejo et al., 2009). TH taktiež ovplyvnila koncetráciu stresových a obranných hormónov. Úmerne so zvýšením obsahu hormónov ACC a ABA sa zvýšili aj hormóny JA (kyselina jasmonová) a SA (kyselina salicylová), ktoré sú zodpovedné za aktiváciu obranných mechanizmov a zvýšenú rezistenciu rastliny (Martínez-Medina et al., 2010).
Pri pokuse s niekoľkými izolátmi Trichodermy harzanium, ktoré boli použité na ošetrenie ryže siatej (Oryza sativa L.) vystavenej suchu sa ukázalo, že v čase, kedy bolo už 81 – 100 % neošetrenej kontroly zvädlej, vykazovala ošetrená ryža max. 40 % povedlosť. Po 7 – 9 dňoch vystavenia suchu, bola u sledovaných ošetrených rastlín zaznamenaná 20 – 100 % zvädlosť, 100 % rastlín kontroly bolo však v oboch prípadoch zberu dát po smrti. U jednoho zo sledovaných izolátov dokonca začalo vednutie až medzi 5. a 7. dňom, teda v čase kedy rastliny kontroly na následky sucha už odumierali (Shukla et al., 2012).
U stresovaných rastlín boli taktiež sledované ďalšie rozdiely. Výmena plynov prieduchmi klesla u kontroly o 71 % a u Trichodermy o 32 – 45 %, priebeh fotosyntézy žnížený u kontroly o 70 % bol u Trichodermy menší o 18 – 27 %. Taktiež boli zaznamenané výrazné rozdiely v obsahu chlorofylu – 98 % pokles u kontroly a 32 – 49 % u Trichodermy. Zníženie indexu membránovej stability u Trichodermy o 20 – 37 % oproti 51 % u kontroly. Zvýšenie obsahu H2O2 v dôsledku stresu u kontroly o 47 % a u Trichodermy o 10 – 23 % (Shukla et al., 2012). Najväčšie zvýšenia výnosu po aplikácii Trichodermy, sú preto sledované práve u rastlín vystavených určitému druhu stresu (Harman, 2000).

Rast koreňov a prístup k vode

Zlepšeným rastom podzemných častí pomáha Trichoderma zväčšiť koreňovú plochu, čím zlepšuje prístup k pôdnym minerálom, čo sa odrazí na vitalite rastliny predovšetkým na málo výživných pôdach (Ousley et al., 1994a). Intenzívnejší rast podzemných častí, kedy niektoré časti koreňa rastú výrazne hlbšie do pôdy (obr. č. 3), má pozitívny vplyv na prístup rastliny k vode, čo pomáha ošetreným rastlinám k menšej úmrtnosti pri vystavení suchu ako u rastlín kontroly (Limón et Codón, 2004).

Obr. č. 3: Stimulácia koreňového rastu u tabaku ošetreného Trichodermou harzianum CECT 2413 (Limón et Codón, 2004).

Koncentrácia minerálov

Po aplikácii Trichodermy v rastline významne vzrastá obsah minerálov ako je P a Fe. Nárast koncetrácie P a Fe bol v podzemných častiach zaznamenaný už po 48 h po inokulácii (v nadzemných častiach po 96 – 120 h). U rastlín starých 28 dní, bola nameraná koncentrácia Fe oproti kontrole vyššia o 30 % a u P až o 90 %. Signifikantné zvýšenia koncentrácií boli zaznamenané aj u Cu, Zn, Mn a Ca (Yedidia et al., 2001).

Kolonizácia koreňov

Trichoderma kolonizuje koreň rastliny podobným spôsobom akým napáda iné pôdne huby. Nepôsobí tu však žiadne masívne poškodenia. Kolonizuje epidermis a preniká maximálne do vonkajších vrstiev prvotnej koreňovej kôry – kortexu (Yedidia et al., 1999). Rastlina na inváziu reaguje vytváraním obranných ložísk zhrubnutých bunkových stien (obr. č. 4) a syntézou biochemických látkok, ktoré limitujú rast Trichodermy (Harman et al., 2004).


Obr. č. 4: Schéma kolonizácie koreňov Trichodermou harzanium (Harman et al., 2004).

4.6.3 Vplyv na iné huby

Prítomnosť Trichodermy harzanium spolu s hubami schopnými arbuskulárnej mykorízi zvyšuje kolonizáciu koreňov AM hub. Huby arbuskulárnej mykorízi však nemajú žiadny vplyv na kolónie Trichodermy harzanium (Martínez-Medina et al., 2010).

Trichoderma a interakcie s hostiteľom:
Trichoderma detekuje inú hubu a rastie tropicky priamo k nej (Chet et al., 1981). „Vycítenie“ iného organizmu na ďiaľku je z časti dané vylučovaním enzýmu degradujúcim bunečné steny. Rôzne druhy môžu mať rôzne taktiky útoku, ale podľa všetkého produkujú malé množstvá exochitinázy (ECH42 – CHIT42). Prenikanie tohto enzýmu do budúceho hostiteľa spúšťa uvoľňovanie oligosacharidov z jeho bunkovej steny, čo následne vyúsťuje k hlavnej útočnej reakcii - vylučovaniu fungitoxickej endochitinázy (NAG1 – CHIT73), ktorá ale taktiež napáda hostiteľa ešte pred vzájomným dotykom (Zeilinger et al., 1999). Po uskutočnení kontaktu sa Trichoderma pripne k hostiteľovi a rastie pozdĺž jeho hýf, prípadne ich aj obtáča alebo tvorí obtáčavé ramená a na jeho povrchu tvorí apresóriá (plochý terčovitý útvar, ktorým sa parazitická huba spojí s hostiteľom) (obr. č. 5). Keď hýfy Trichodermy harzanium dorastú k starším častiam kolónie hostiteľa, na miestach apresórií sa na hostiteľskej hýfe vytvoria diery, cez ktoré začne Trichoderma prerastať do vnútra hostiteľského mycélia. Hýfy Trichodermy sa množia a vytvárajú hustú sieť, ktorá trávy obtočené mycélium konkurenčnej huby (Harman et al., 2004; Inbar et al., 1996).

Aktivita Trichodermou vylučovaných chitináz, β-1,3-glukanáz, proteáz a iných enzýmov rastie prvých 30 – 35 hodín, následne pomaly klesá. Vylučuje aj antibiotické látky peptidovej povahy – peptaiboly. Súčasné pôsobenie antibiotík spolu s hydrolitickými enzýmami degradujúcimi bunkové steny je potrebné k maximálnej učinnosti mykoparazitizmu Trichodermy.
Pre úplné zastavenie klíčenia spórov bez prítomnosti enzýmov bolo v laboratórnych podmienkach potreba 200 µg/ml trichorzianinu A1, po pridaní 25 µg endochitinázi na ml, bolo množstvo trichorzianinu znížené na 30 µg/ml. Množstvo enzýmu 25 µg/ml bez pridania antibiotika, stačí iba na 35 % zníženie klíčivosti spórov (Schirmböck et al., 1994).
Enzýmy najprv oslabia bunkovú stenu, cez ktorú tak môžu ľahšie preniknúť antibiotické látky ako napríklad gliotoxin a peptaiboly (lineárne peptidy o veľkosti 5 – 20 aminokyselín, obsahujúce kyselinu α-amino-isomaselnú s anglickou skratkou Aib, z ktorích sú niektoré označované ako trichorzianíny (Szekeres et al., 2005)) ktoré narušujú cytoplazmatickú membránu bunky, čím spôsobia jej smrť (Schirmböck et al., 1994).

Vplyv Trichodermy harzanium na hostiteľa nie je jednostranný. Kolónia Trichodermy prerastajúca agar, ktorá bola následne inokulovaná fytopatogénnou hubou rodu Fusarium vyzakovala spomalený rast. Pôsobenie týchto mikroorganizmov je teda vzájomné (Kim et Knudsen, 2013).
Zoznam rastlino-patogénnych húb na ktoré má Trichoderma efekt zahrňuje rody: Armillaria, Botrytis, Chondrostereum, Colletrotrichum, Demathopora, Diaporthe, Endothia, Fulvia, Fusarium, Fusicladium, Helminthosporium, Macrophomina, Monilia, Nectria, Phoma, Phytophthora, Plasmopara, Pseudoperonospora, Pythium, Rhizoctonia, Rhizopus, Sclerotinia, Sclerotium, Venturia, Verticillium, hniloba dreva a iné.
Príklady komerčne predávaných produktov proti týmto pateogénom, ktoré obsahujú Trichodermu:
- Trichodex (Izrael) proti Botrytis na zelenine a réve vinnej
- Binab-T (Švédsko) proti hnilobe a trúchniveniu dreva
- Supersivit (Dánsko) proti rozličným hubám
- Trichoderma 2000 (Izrael) proti R. solani, S. rolfsii, Pythium spp., Fusarium spp.
- TUSAL (Španielsko) pre tlmenie chorôb spôsobených rodmi Pythium, Phoma a Rhizoctonia, proti rizománii cukrovej repy a Sclerotinii na šaláte
(Monte, 2001).

4.6.4 Chemická podobnosť gliotoxínu a GA3

Výrazná štrukturálna podobnosť gliotoxínu a kyseliny giberelovej, obzvlášť vo vyskytujúcich sa funkčných skupinách (obr. č. 7), ktoré majú hlavnú úlohu v určovaní chemických vlastností látky, umožňuje gliotoxínu napojiť sa na rovnaký receptor GID1 ako kyselina giberelová (Bezuidenhout et al., 2012).



Výsledky


Z grafu, ktorý porovnáva počty samčích rastlín konopy siatej na jednotlivých opakovaniach plochy naočkovanej Trichodermou harzanium (modrá) a kontrolou (žltá) je zrejmé, že ich počet je u kontroly podstatne nižší. Priemerný výskyt samčích rastlín na plochách kontroly je 7,89 %, čo sa dá prisúdiť postupnej zmene jednodomosti na dvojdomosť. Na plochách inokulovaných Trichodermou harzanium je priemerný výskyt samcov 29,63 %.

Na plochách kontroly uhynula v priemere každá tretia rastlina (33,33 %). Uhynulo 19 z 57 rastlín, oproti tomu na plochách ošetrených Trichodermou bola úmrtnosť iba 5,26 %, kde uhynuli 3 rastliny z pôvodného počtu 57.


Diskusia

V tejto štúdii bol zaznamenaný signifikantný vplyv Trichodermy harzanium na rastliny jednodomej variety konopy siatej Bialobrzeskie. Bohužiaľ na porast inokulovaný Trichodermou mala negatívny vplyv zver, ktorej stopy boli nájdené na všetkých 4 pokusných plochách. Rozrytím niektorích miest a následným zvýšením vrstvy pôdy na zvyšku plochy bola predĺžená doba klíčenia, čím získali rastliny kontroly niekoľko centrimetrovú rastovú výhodu, ktorú sa už rastlinám Trichodermy nepodarilo vyrovnať. Z tohto dôvodu sme zavrhli porovnávanie kvantitatívnych znakov ako výška a hmotnosť rastlín a zamerali sme sa na zhodnotenie rozdielov medzi pokusnými plochami v úmrtnosti a pomeru pohlaví.
Výsledky ukázali, že Trichoderma harzanium a jej vplyv na hladinu hormónov v tele rastliny veľmi významne ovplyvňuje obe sledované znaky. Koncentrácia a pomer auxínov a giberelínov hrá hlavnú úlohu v určovaní pohlavia u rastlín konopy (Ram et Jaiswal, 1972) a práve na tieto (a iné) hormóny pôsobí aplikovaná huba Trichoderma harzanium (Martínez-Medina et al., 2010; Honeefat et al., 2012). Zmena koncentrácií týchto hormónov spôsobila na plochách inokulovaných Trichodermou zvýšenie počtu samčích rastlín o takmer 22 % oproti plochám kontroly. Je možné, že na tomto zvýšení sa vo väčšej či menšej miere podieľa aj antibiotikum syntetizované Trichodermou harzanium gliotoxín, ktorému jeho chemické zloženie, podobné kyseline giberelovej, zaručuje napojenie na rovnaké receptory ako spomínaná kyselina (Bezuidenhout et al., 2012).
Trichoderma harzanium taktiež spôsobuje zlepšený rast koreňov a zvýšenú produkciu obranných hormónov a zlepšuje hospodárenie rastliny s vodou, čím zvyšuje jej schopnosť prežiť zhoršené podmienky alebo útoky fytopatogénov (Limón et Codón, 2004; Shukla et al., 2012; Martínez-Medina et al., 2010).. Ošetrené plochy vykazovali preukázateľne menšiu úmrtnosť rastlín ako plochy kontroly. Počet rastlín inokulovanej plochy sa znížil z počiatočných 57 na výsledných 54, kdežto u kontroly bolo pri žatve zaznamenaných iba 38 z pôvodných 57 rastlín. Za značný úhyn pravdepodobne môžu extrémne vysoké teploty a sucho, ktoré panovali počas vegetačnej fázy, obzvlášť v júli (obr. č. 8 a obr. č. 9). Vysoká odolnosť voči suchu na ploche ošetrenej Trichodermou harzanium potvrdzuje výsledky Shuklu (2012).


Záver

Z použiteľných dát bolo preukázané, že inokulácia pôdy Trichodermou harzanium v poraste konopy siatej má významný vplyv na rastliny. Lepšia odolnosť voči nedostatku vody a tým pádom aj znížená mortalita porastu by bola výborne využiteľná pri poľnohospodárskom pestovaní konopy. Naopak zvýšený výskyt samčích rastlín je v poraste, v ktorom je kvôli ich skoršiemu odumieraniu požadovaná čo možno maximálna jednodomosť, nevhodný. Aplikácia Trichodermy harzanium by mohla byť prínosom v poľohospodárskych porastoch, pestovaných výhradne na vlákno, kedže samčie rastliny tu niesú nevýhodou vďaka skoršej žatve.
Prípadný ďalší výskum by sa mal zamerať na vplyv Trichodermy harzanium na výšku a hmotnosť sušiny konopy. Taktiež je treba objasniť, či hrajú auxíny a kyselina giberelová jedinú rolu v procese zmeny pohlavia konopy alebo sa na tomto procese podieľa (a do akej miery) aj prítomnosť gliotoxínu. Rozdiely v účinkoch by mohli byť zaznamenané aj medzi jednodomými a dvojdomými varietami technickej konopy.